影响生物发酵制氢反应器工艺运行的因素很多，例如温度、溶液的pH值、底物、水利停留时间等。
(1)温度
温度影响生物发酵细菌产氢代谢的速度，不同妨碍袄产氢细菌的产氢温度存在较大差异。研究结果表明，大部分发酵产氢菌属于嗜温菌，目前还没有常温发酵产氢菌的报道；而高温发酵产氢菌的报道也很少，最高的温度为55℃时，可以达到较好的产氢效果。
(2)pH值
溶液的pH值是影响生物发酵制氢工艺的重要参数之一，原因是pH值对细菌微生物的代谢会造成影响，直接影响到产氢微生物细胞内部氢化酶的活性、细胞的氧化还原电位、代谢产物的种类和形态、基质的利用性。大部分的研究报道表明，生物发酵微生物通常在弱酸性的条件下，可以发挥较高的产氢效率。pH值的高低直接影响到代谢的产物，当pH值较高时，发酵代谢产物以酸类为主，当pH值较低时，发酵代谢产物主要是酮类和醇类。乙醇型发酵的产氢pH值为 4.2~4.5,丁酸型的发酵产氢pH值为6.0~6.5。
(3)底物
底物对生物发酵制氢效率的影响是很明显的，理论研究时所采用的底物通常有葡萄糖、蔗糖、淀粉、纤维素等，这些碳水化合物分子结构比较简单。而以有机废弃物作为底物的生物发酵制氢就变得非常复杂，废水的来源不同，底物的成分就会千差万别。对于利用有机废弃物进行生物发酵制氢，首先对这些成分复杂的废弃物进行预处理；使废弃物中的有机物可以或者易被产氢微生物所利用，通常的预处理方法有5种，即超声波震荡处理、酸处理、灭菌处理、冻融处理和添加甲烷菌抑制剂。研究结果表明，冻融和酸处理的产氢效果好，其次是灭菌处理。底物中无机营养元素对发酵制氢菌细胞的生产是必须的，无机营养元素的添加可以直接影响生物发酵制氢的进程，例如Fe,作为细胞内酶活性重心的重要组成部分，可以维持生物大分子和细胞结构的稳定性，氢化酶的活性随着铁的消耗而下降；铁也是铁氧化还原蛋白的重要组分。
(4)水利停留时间
如果采用连续型发酵产氢装置，水利停留时间就成为很重要的影响因素。由于发酵制氢反应器的类型不同，水利停留时间会存在差异，通常情况下，水利停留时间为2~24h。